懸浮細(xi)胞總(zong)是在孵抗體和洗的時候被沖掉(diao)，懸浮細(xi)胞做免疫熒光怎么固定(ding)？

傳統(tong)方法

實驗步驟：

1. 細(xi)胞在冰浴(yu)中冷卻，然后(hou)用臺(tai)式離(li)心(xin)機于4℃以(yi)(yi)800 g 離(li)心(xin)5 min，吸去(qu)培(pei)養液并以(yi)(yi)4℃PBS重懸細(xi)胞。

2. 離心吸去PBS，以(yi)1~2 ml 2%PFA固定(ding)液，或2%PFA固定(ding)液/0.1% Triton X-100重懸細胞，置冰上固定(ding)30 min。

3. 離心、吸(xi)去(qu)固定液(ye)，用(yong)15 ml 4℃ PBS重懸細胞，放5 min 后(hou)，用(yong)PBS再(zai)次洗滌(di)細胞。

4. 稀釋的第一抗體于(yu)4℃用(yong)微量離心(xin)機以13 500 g 離心(xin)2 min，250 μl 抗體足夠(gou)用(yong)于(yu)5x106細胞。

5. 離(li)心細胞，吸去PBS，重懸細胞于(yu)第一抗體(ti)中，置(zhi)4℃溫育1 h。

6. 用(yong)4℃ PBS稀釋細胞和抗體至15 ml。

7. 離(li)心，吸去PBS，以4℃ PBS重(zhong)懸細胞，重(zhong)復1次。

8. 第二抗(kang)體4℃用微量離心(xin)機(ji)以(yi)13 500 g 離心(xin)2 min，5x106細(xi)胞用250 ul 抗(kang)體足夠。

9. 吸去PBS，以第二抗體(ti)重懸(xuan)細胞，4℃溫育(yu)1 h，重復步驟6及步驟7。

10. 除非立即觀察細胞，否(fou)則在進行(xing)細胞濃縮的下(xia)一步操作之前應以(yi)鋁萡包裹離心(xin)管并(bing)冷藏。

11. 離心細(xi)胞并以少量(liang)PBS重懸(xuan)（勿用水），將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)滴于多聚(ju)-L-賴氨(an)酸覆層的(de)載玻(bo)片上，加上蓋玻(bo)片，盡可(ke)能馬(ma)上觀察結果。 

鏡下觀察(cha)：沒(mei)有細胞，原(yuan)來(lai)掉片了！！！

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